1414 Bygging og starfsemi DNA

14.1 Sögulegur grunnur nútímaskilnings

Námsmarkmið

Í lok þessa hluta munt þú geta:

Útskýrt erfðaummyndun baktería
Lýst lykiltilraunum sem sýndu að DNA er erfðaefnið
Sett fram og útskýrt reglur Chargaffs

Nútímaskilningur okkar á DNA hófst með uppgötvun kjarnsýra og síðar þróun tvöfalda gormlíkans DNA. Á sjöunda áratug 19. aldar einangraði Friedrich Miescher (mynd 14.2), sem var læknir að mennt, fosfatrík efni úr hvítum blóðkornum (hvítfrumum). Hann nefndi þessi efni, sem síðar urðu þekkt sem DNA, núkleín vegna þess að þau voru einangruð úr frumukjörnum.

Photo of Friedrich Miescher. — **Mynd 14.2.** Friedrich Miescher (1844-1895) uppgötvaði kjarnsýrur.

Hálfri öld síðar, árið 1928, greindi breski sýklafræðingurinn Frederick Griffith fyrstur frá erfðaummyndun baktería, ferli þar sem fruma tekur upp utanaðkomandi DNA og breytir þar með gerð sinni og lífeðlisfræði. Griffith gerði tilraunir sínar með Streptococcus pneumoniae, bakteríu sem veldur lungnabólgu. Griffith vann með tvo stofna þessarar bakteríu, hrjúfan (R) og sléttan (S). Frumugerðirnar tvær voru nefndar „hrjúfar“ og „sléttar“ eftir útliti þyrpinga þeirra á næringaragarplötu.

R-stofninn er ekki sjúkdómsvaldandi (veldur ekki sjúkdómi). S-stofninn er sjúkdómsvaldandi og hefur hjúp utan um frumuvegginn. Hjúpurinn gerir frumunni kleift að komast hjá ónæmissvörun hýsilmúsarinnar.

Þegar Griffith sprautaði lifandi S-stofni í mýs dóu þær úr lungnabólgu. Þegar hann sprautaði lifandi R-stofni í mýs lifðu þær hins vegar af. Í annarri tilraun lifðu mýsnar einnig af þegar hann sprautaði þær með hitadrepnum S-stofni. Þessi tilraun sýndi að hjúpurinn einn og sér olli ekki dauða músanna. Í þriðju tilraunaröðinni var blöndu af lifandi R-stofni og hitadrepnum S-stofni sprautað í mýs og, honum til undrunar, dóu mýsnar. Þegar lifandi bakteríur voru einangraðar úr dauðu músunum fékkst aðeins S-stofn baktería. Þegar þessum einangraða S-stofni var sprautað í nýjar mýs dóu þær. Griffith ályktaði að eitthvað hefði borist frá hitadrepna S-stofninum yfir í lifandi R-stofninn og umbreytt honum í sjúkdómsvaldandi S-stofn. Hann kallaði þetta ummyndunarþáttinn (mynd 14.3). Þessar tilraunir eru nú þekktar sem ummyndunartilraunir Griffiths.

Four scenarios in an experiment are shown. In the first, living S cells are injected, and the mouse dies. In the second, living R cells are injected, and the mouse is healthy. In the third, heat-killed S cells are injected, and the mouse is healthy. In the fourth, mixture of heat-killed S cells and Living R cells are injected, and the mouse dies and living S cells are recovered. — **Mynd 14.3.** Tveir stofnar af S. pneumoniae voru notaðir í ummyndunartilraunum Griffiths. R-stofninn er ekki sjúkdómsvaldandi en S-stofninn er sjúkdómsvaldandi og veldur dauða. Þegar Griffith sprautaði mús með hitadrepnum S-stofni og lifandi R-stofni dó músin. S-stofninn fékkst úr dauðu músinni. Griffith ályktaði að eitthvað hefði borist frá hitadrepna S-stofninum til R-stofnsins og umbreytt R-stofninum í S-stofn. Mynd: Rao, A., Ryan, K. og Tag, A., líffræðideild Texas A&M University.

Vísindamennirnir Oswald Avery, Colin MacLeod og Maclyn McCarty (1944) vildu rannsaka þennan ummyndunarþátt nánar. Þeir einangruðu S-stofninn úr dauðum músum og einangruðu prótein og kjarnsýrur (RNA og DNA), enda voru þetta möguleg burðarefni erfða. Þeir notuðu ensím sem brutu sértækt niður hvern þátt fyrir sig og notuðu síðan hverja blöndu sérstaklega til að ummynda R-stofninn. Þeir komust að því að þegar DNA var brotið niður gat blandan ekki lengur ummyndað bakteríurnar, en allar hinar blöndurnar gátu það. Þetta leiddi til þeirrar niðurstöðu að DNA væri ummyndunarþátturinn.

Starfsferill

Réttarvísindamaður

Réttarvísindamenn notuðu sönnunargögn úr DNA-greiningu í fyrsta sinn til að leysa innflytjendamál. Sagan hófst með unglingspilti sem sneri aftur til London frá Gana til að vera hjá móður sinni. Innflytjendayfirvöld á flugvellinum grunuðu hann um að ferðast á fölsuðu vegabréfi. Eftir miklar fortölur fékk hann leyfi til að fara og búa hjá móður sinni, en innflytjendayfirvöld felldu málið gegn honum ekki niður. Ýmis sönnunargögn, þar á meðal ljósmyndir, voru lögð fram fyrir yfirvöld, en brottvísunarmál var engu að síður hafið. Um svipað leyti hafði dr. Alec Jeffreys við háskólann í Leicester í Bretlandi fundið upp tækni sem kallast DNA-fingrafaragreining. Innflytjendayfirvöld leituðu til dr. Jeffreys eftir aðstoð. Hann tók DNA-sýni úr móðurinni og þremur börnum hennar, auk sýnis úr óskyldri móður, og bar þau saman við DNA piltsins. Þar sem líffræðilegi faðirinn var ekki til staðar var DNA barnanna þriggja borið saman við DNA piltsins. Hann fann samsvörun milli DNA piltsins og DNA bæði móðurinnar og systkina hans þriggja. Hann ályktaði að pilturinn væri sannarlega sonur móðurinnar.

Réttarvísindamenn greina margs konar gögn, þar á meðal skjöl, rithönd, skotvopn og lífsýni. Þeir greina DNA-innihald hárs, sæðis, munnvatns og blóðs og bera það saman við gagnagrunn yfir DNA-snið þekktra afbrotamanna. Greiningin felur í sér einangrun DNA, raðgreiningu og greiningu raða. Gert er ráð fyrir að réttarvísindamenn mæti fyrir dóm til að kynna niðurstöður sínar. Þeir starfa yfirleitt á rannsóknarstofum lögreglu eða opinberra stofnana. Erfðafræðingar sem gera tilraunir með DNA-tækni starfa einnig hjá vísinda- og rannsóknastofnunum, lyfjafyrirtækjum og á rannsóknarstofum háskóla. Nemendur sem vilja leggja fyrir sig starf réttarvísindamanns ættu að hafa að minnsta kosti BS-próf í efnafræði, líffræði eða eðlisfræði og helst einhverja reynslu af rannsóknarstofuvinnu.

Þó að tilraunir Avery, McCarty og MacLeod hefðu sýnt að DNA væri upplýsingaburðurinn sem fluttist við ummyndun, var DNA enn talið of einföld sameind til að bera líffræðilegar upplýsingar. Prótein, með 20 mismunandi amínósýrur, voru talin líklegri burðarefni. Úrslitatilraunin, sem Martha Chase og Alfred Hershey gerðu árið 1952, staðfesti að DNA væri sannarlega erfðaefnið en ekki prótein. Chase og Hershey rannsökuðu bakteríufaga, veiru sem sýkir bakteríur. Veirur hafa yfirleitt einfalda byggingu: próteinhjúp, sem kallast veiruhylki, og kjarnsýrukjarna sem inniheldur erfðaefnið (annaðhvort DNA eða RNA). Bakteríufaginn sýkir hýsilbakteríuna með því að festast við yfirborð hennar og sprautar síðan kjarnsýru sinni inn í frumuna. Faga-DNA myndar mörg afrit af sjálfu sér með því að nýta vélbúnað hýsilsins og að lokum springur hýsilfruman og losar mikinn fjölda bakteríufaga. Hershey og Chase völdu geislavirk frumefni sem greindu próteinið sérstaklega frá DNA í sýktum frumum. Þau merktu einn fagaskammt með geislavirkum brennisteini, ³⁵S, til að merkja próteinhjúpinn. Annar fagaskammtur var merktur með geislavirkum fosfór, ³²P. Þar sem fosfór er í DNA en ekki próteini myndi DNA, en ekki próteinið, merkjast með geislavirkum fosfór. Á sama hátt er brennisteinn ekki í DNA en er í nokkrum amínósýrum, svo sem meþíóníni og cysteini.

Hverjum fagaskammti var leyft að sýkja frumurnar sérstaklega. Eftir sýkingu var faga- og bakteríublandan sett í blandara, sem olli því að fagahjúpurinn losnaði frá hýsilfrumunni. Frumur sem höfðu verið útsettar nógu lengi til að sýking gæti átt sér stað voru síðan skoðaðar til að sjá hvor af geislavirku sameindunum tveimur hefði farið inn í frumuna. Faga- og bakteríublandan var skilin í skilvindu. Þyngri bakteríufrumurnar settust til botns og mynduðu botnfall, en léttari fagaagnirnar urðu eftir í flotinu. Í glasinu sem innihélt faga merkta með ³⁵S var flotið með geislamerktum fögum, en engin geislavirkni mældist í botnfallinu. Í glasinu sem innihélt faga merkta með ³²P mældist geislavirkni í botnfallinu, þar sem þyngri bakteríufrumurnar voru, en engin geislavirkni mældist í flotinu. Hershey og Chase ályktuðu að faga-DNA væri sprautað inn í frumuna og bæri upplýsingarnar sem þarf til að framleiða fleiri fagaagnir. Þannig sýndu þau fram á að DNA, en ekki prótein, væri erfðaefnið (mynd 14.4).

Illustration shows bacteria being infected by phage labeled with superscript 35 baseline upper case S, which is incorporated into the protein coat, or superscript 32 baseline upper case P, which is incorporated into the D N A. Infected bacteria were separated from phage by centrifugation and cultured. The bacteria that had been infected with phage containing superscript 32 baseline upper P labeled D N A made radioactive phage. The bacteria that had been infected with superscript 35 baseline upper S labeled phage produced unlabeled phage. The results support the hypothesis that D N A, and not protein, is the genetic material. — **Mynd 14.4.** Í tilraunum Hershey og Chase voru bakteríur sýktar með geislamerktum fögum, annaðhvort með ³⁵S, sem merkir prótein, eða ³²P, sem merkir DNA. Aðeins ³²P fór inn í bakteríufrumurnar, sem bendir til þess að DNA sé erfðaefnið.

Um svipað leyti rannsakaði austurríski lífefnafræðingurinn Erwin Chargaff DNA-innihald mismunandi tegunda. Hann komst að því að adenín, týmín, gúanín og cýtósín voru ekki í jöfnu magni og að hlutfallslegur styrkur þessara fjögurra niturbasa var breytilegur milli tegunda, en ekki milli vefja sama einstaklings eða milli einstaklinga sömu tegundar. Hann uppgötvaði einnig nokkuð óvænt: magn adeníns var jafnt magni týmíns og magn cýtósíns var jafnt magni gúaníns (það er $A = T$ og $G = C$ ). Mismunandi tegundir höfðu jafnt magn púrína (A + G) og pýrimídína (T + C), en hlutföll A + T á móti G + C voru mismunandi. Þessar athuganir urðu þekktar sem reglur Chargaffs. Niðurstöður Chargaffs reyndust mjög gagnlegar þegar Watson og Crick undirbjuggu tillögu sína að tvöfalda gormlíkani DNA. Eftir lestur síðustu síðna má sjá hvernig vísindin byggja á fyrri uppgötvunum, stundum í hægu og erfiðu ferli.