14.4 Eftirmyndun DNA í dreifkjörnungum
14.4 DNA eftirmyndun í dreifkjörnungum
Námsmarkmið
Í lok þessa hluta munt þú geta:
- Útskýrt ferli DNA-eftirmyndunar í dreifkjörnungum
- Rætt hlutverk mismunandi ensíma og próteina sem styðja þetta ferli
DNA-eftirmyndun hefur verið vel rannsökuð í dreifkjörnungum, fyrst og fremst vegna smæðar erfðamengisins og mikils fjölda tiltækra stökkbrigða. E. coli hefur 4,6 milljónir basapara í einum hringlaga litningi og allt erfðamengið eftirmyndast á um það bil 42 mínútum. Eftirmyndunin hefst á einum stað á litningnum og heldur áfram í báðar áttir um hringinn. Þetta þýðir að um það bil 1000 kirnum er bætt við á sekúndu. Ferlið er því mjög hratt og á sér stað með fáum mistökum.
DNA-eftirmyndun notar fjölda stoðpróteina og ensíma sem hvert gegnir mikilvægu hlutverki í ferlinu. Einn lykilþátturinn er ensímið DNA-pólýmerasi, einnig kallað DNA pol, sem bætir kirnum einu af öðru við vaxandi DNA-keðju sem er samstæð mótstrengnum. Viðbót kirna krefst orku; hún fæst úr núkleósíðþrífosfötunum dATP, dGTP, dTTP og dCTP. Líkt og ATP eru hin NTP-efnin (núkleósíðþrífosfötin) orkuríkar sameindir sem geta bæði verið uppspretta DNA-kirna og orkugjafi fyrir fjölliðunina. Þegar tengið milli fosfatanna er rofið er orkan sem losnar notuð til að mynda fosfódíestertengi milli kirnisins sem bætist við og vaxandi keðjunnar. Í dreifkjörnungum eru þrjár megingerðir pólýmerasa þekktar: DNA pol I, DNA pol II og DNA pol III. Nú er vitað að DNA pol III er ensímið sem þarf til DNA-nýmyndunar; DNA pol I er mikilvægt hjálparensím í DNA-eftirmyndun og ásamt DNA pol II er það fyrst og fremst nauðsynlegt fyrir viðgerðir.
Hvernig veit eftirmyndunarvélin hvar hún á að byrja? Í ljós kemur að sértækar kirnaraðir, sem kallast upphafsstaðir eftirmyndunar, marka staðina þar sem eftirmyndun hefst. Í E. coli, sem hefur einn upphafsstað eftirmyndunar á sínum eina litningi eins og flestir dreifkjörnungar, er þessi upphafsstaður um það bil 245 basapör að lengd og ríkur af AT-röðum. Ákveðin prótein þekkja upphafsstaðinn og bindast honum. Ensím sem kallast helíkasi vindur ofan af DNA með því að rjúfa vetnistengin milli niturbasapara. ATP-vatnsrof er nauðsynlegt fyrir þetta ferli. Þegar DNA opnast myndast Y-laga byggingar sem kallast eftirmyndunarkvíslar. Tvær eftirmyndunarkvíslar myndast við upphafsstað eftirmyndunar og lengjast í báðar áttir eftir því sem eftirmyndun heldur áfram. Einþátta bindiprótein þekja einþátta DNA nálægt eftirmyndunarkvíslinni til að koma í veg fyrir að einþátta DNA vindist aftur upp í tvöfaldan gorm.
DNA-pólýmerasi hefur tvær mikilvægar takmarkanir: hann getur aðeins bætt kirnum við í 5′ til 3′ stefnu, þannig að nýr DNA-þráður getur aðeins lengst í þessa stefnu. Hann þarf einnig lausan 3′-OH-hóp sem hann getur bætt kirnum við með því að mynda fosfódíestertengi milli 3′-OH-endans og 5′-fosfats næsta kirnis. Þetta þýðir í raun að hann getur ekki bætt við kirnum ef laus 3′-OH-hópur er ekki til staðar. Hvernig bætir hann þá við fyrsta kirninu? Vandamálið er leyst með hjálp vísis sem veitir lausan 3′-OH-enda. Annað ensím, RNA-prímasi, nýmyndar RNA-bút sem er um fimm til tíu kirni að lengd og samstæður DNA-mótinu. Þar sem þessi röð undirbýr DNA-nýmyndunina kallast hún vísir. DNA-pólýmerasi getur nú lengt RNA-vísinn og bætt við kirnum einu af öðru sem eru samstæð mótstrengnum (mynd 14.14).
Eftirmyndunarkvíslin hreyfist um 1000 kirni á sekúndu. Tópóísómerasi kemur í veg fyrir ofvindingu DNA-tvöfalda gormsins framan við eftirmyndunarkvíslina þegar DNA er að opnast; hann gerir það með því að valda tímabundnum rofum í DNA-gorminum og loka honum síðan aftur. Þar sem DNA-pólýmerasi getur aðeins lengt í 5′ til 3′ stefnu og DNA-tvöfaldi gormurinn er andsamsíða skapast smávægilegt vandamál við eftirmyndunarkvíslina. Mótstrengirnir tveir hafa gagnstæða stefnu: annar er í 5′ til 3′ stefnu og hinn í 3′ til 5′ stefnu. Aðeins einn nýr DNA-þráður, sá sem er samstæður 3′ til 5′ foreldrastrengnum, getur verið nýmyndaður samfellt í átt að eftirmyndunarkvíslinni. Þessi samfellt nýmyndaði þráður kallast leiðandi strengur. Hinn þráðurinn, sem er samstæður 5′ til 3′ foreldrastrengnum, er lengdur frá eftirmyndunarkvíslinni í litlum bútum sem kallast Okazaki-bútar, og hver þeirra þarf vísi til að hefja nýmyndunina. Nýir vísisbútar eru lagðir niður í átt að eftirmyndunarkvíslinni, en hver þeirra vísar frá henni. Okazaki-bútar eru nefndir eftir japanska vísindamanninum sem uppgötvaði þá fyrst. Strengurinn með Okazaki-bútunum kallast seinni strengur.
Leiðandi strengurinn getur lengst út frá einum vísi, en seinni strengurinn þarf nýjan vísi fyrir hvern stuttan Okazaki-bút. Heildarstefna seinni strengsins verður 3′ til 5′ og stefna leiðandi strengsins 5′ til 3′. Prótein sem kallast renniklemma heldur DNA-pólýmerasanum á sínum stað á meðan hann heldur áfram að bæta við kirnum. Renniklemman er hringlaga prótein sem binst DNA og heldur pólýmerasanum á sínum stað. Eftir því sem nýmyndun heldur áfram er RNA-vísum skipt út fyrir DNA. Vísarnir eru fjarlægðir með útkirnaskeravirkni DNA pol I, sem notar DNA fyrir aftan RNA sem sinn eigin vísi og fyllir í eyðurnar sem myndast þegar RNA-kirnin eru fjarlægð með því að bæta við DNA-kirnum. Rofin sem eftir standa milli nýmyndaðs DNA, sem kom í stað RNA-vísisins, og áður nýmyndaðs DNA eru innsigluð af ensíminu DNA-lígasa, sem hvatar myndun fosfódíestertengja milli 3′-OH-enda eins kirnis og 5′-fosfatenda hins bútarins.
Þegar litningurinn hefur verið fullkomlega eftirmyndaður færast DNA-afritin tvö í tvær mismunandi frumur við frumuskiptingu.
Ferli DNA-eftirmyndunar má draga saman á eftirfarandi hátt:
Tafla 14.1 tekur saman ensímin sem koma að DNA-eftirmyndun dreifkjörnunga og hlutverk hvers þeirra.
| Ensím/prótein | Sértækt hlutverk |
|---|---|
| DNA pol I | Fjarlægir RNA-vísa og skiptir þeim út fyrir nýmyndað DNA |
| DNA pol III | Aðalensímið sem bætir kirnum við í 5′ til 3′ stefnu |
| Helíkasi | Opnar DNA-gorminn með því að rjúfa vetnistengi milli niturbasa |
| DNA-lígasi | Tengir Okazaki-búta saman og myndar samfelldan DNA-þráð |
| Prímasi | Nýmyndar RNA-vísa sem þarf til að hefja eftirmyndun |
| Renniklemma | Heldur DNA-pólýmerasanum á sínum stað þegar kirnum er bætt við |
| Tópóísómerasi | Léttir spennu á DNA við afvindingu með tímabundnum rofum og lokar DNA síðan aftur |
| Einþátta bindiprótein (SSB) | Bindast einþátta DNA og koma í veg fyrir að DNA vefjist aftur saman |